引言

　　高海拔地區具有低壓、低氧、高輻射等特點，使機體氧分壓降低，血氧飽和度降低，組織細胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生增多 [1]，細胞還原狀態增加，線粒體膜電位降低，導致氧化應激和線粒體功能障礙 [2]。已有研究發現，低壓低氧環境下缺氧誘導因子(hypoxia inducible factors，HIFs)表達水平顯著升高，HIFs 作為代謝適應氧氣變化的主要調節因子 [3]，HIFs 通過基因表達調控，改變線粒體形態和功能，調控細胞適應蛋白質合成、能量代謝、線粒體呼吸、脂質和碳代謝以及營養獲取，介導細胞對缺氧的適應性代謝反應 [4-5]。研究發現，脾臟具有清除衰老紅細胞、參與免疫應答和血液過濾等功能 [6-7]，能夠調節血液中脂肪、糖分和氨基酸等物質的代謝，幫助維持人體的能量平衡。

　　脾臟是一個消耗大量氧氣的器官，對缺氧非常敏感 [8-9]，但目前對脾臟組織代謝反應研究較少，高原低氧環境對代謝作用機制尚不明確。隨著分子生物學技術的不斷發展，多組學分析技術能夠全面、深入地了解生物體內的生物分子組成和相互作用，提供更精細的測量數據，從而鑒定各種有效的蛋白質、生物標志物等，促進對生物系統的深入了解 [10-11]。因此，本研究以小鼠脾臟為研究對象，基于轉錄組測序、蛋白質組學和非靶向代謝組學，闡明高原低氧環境下碳代謝通路變化的分子機制，為代謝相關疾病研究提供參考依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗動物及分組

　　本實驗所選 SPF 級實驗動物購買于西安交通大學醫學部實驗動物中心，6 - 8 周齡 C57BL/6 雄性健康小鼠，動物許可證號：SYXK2020 - 005。將小鼠隨機分為兩組(每組 5 只)分別飼養于不同海拔，以西安交通大學醫學部實驗動物中心(海拔 400m)作為本次實驗的對照組即平原常氧組模型(plain spleen control，PSC 組);以青海省果洛藏族自治州瑪多縣人民醫院實驗動物房(海拔 4200m)作為實驗組即高原低氧組模型(high - altitude spleen test，HST 組)。在飼養過程中，兩組均維持相同的溫度，濕度，飲水，飲食。飼養 30d 后無菌采集小鼠脾臟組織并保存于液氮中。該項目已通過青海大學倫理協會審查(批準號：2020 - 15)。

　　1.2 實驗試劑與儀器

　　無酶無菌水購自北京 Solarbio 公司;引物購自上海 SangonBioteCh 公司;TrizolRNA 提取試劑購自美國 Invitrogen 公司，于日本 Takara 公司購得逆轉錄試劑盒 [PrimeScript™ RT reagent kit with gDNA Eraser，(RR047A)] 和 qPCR 檢測試劑盒 TB Green® Premix Ex Taq ™ Ⅱ(Tli RNaseH Plus)，(RR820A);硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜購自美國 Pall Corporation 公司。兔源異檸檬酸脫氫酶 3 [isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) alpha，IDH3A] 蛋白抗體、兔源琥珀酸輔酶 A 連接酶(succinateCoenzyme A ligase，SUCLA2)蛋白抗體、兔源蘋果酸脫氫酶 2(malate dehydrogenase 2 ，MDH2)蛋白抗體、兔源磷酸甘油酸變位酶 2(phosphoglycerate mutase 2，PGAM2)蛋白抗體、鼠源烯醇化酶(enolase 3，ENO3)蛋白抗體、兔源磷酸核糖焦磷酸合成酶 2(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2，PRPS2)蛋白抗體和兔源核酮糖 - 5 - 磷酸 - 3 - 差向異構酶(ribulose - 5 - phosphate - 3 - epimerase，RPE)蛋白抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均購自 Proteintech 公司;兔源 6 - 磷酸葡萄糖酸酯酶(6phosphogluconolactonase，PGLS)蛋白抗體購自 Affinity 公司;增強化學發光液(ECL)購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司;熒光定量 PCR 儀(Roche 公司，瑞士);電泳儀、轉膜儀(Bio - Rad 公司，美國);凝膠成像系統(VILBER 公司，法國)。

　　1.3 小鼠脾臟指數測定和組織病理學檢查

　　稱量小鼠空腹體質量后，記錄無菌取出的小鼠脾臟組織質量。通過以下算式計算小鼠脾臟指數：脾臟指數 = 脾臟質量 (g)/ 體質量 (g)×100%。將小鼠脾臟組織置于 40g/L 多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水處理，隨后將組織石蠟包埋切片 5 - 6µm，二甲苯脫蠟后，使用蘇木精和伊紅(H&E)染色，顯微鏡下觀察組織切片。

　　1.4 高通量轉錄組測序

　　總 RNA 的提取：使用 TRIzol 法提取小鼠脾臟組織的總 RNA，檢測其濃度及純度，并立即儲存于 - 80℃冰箱。使用分光光度計進行測量 RNA 濃度及 260/280、260/230 吸光度比值。隨后，采用 Agilent 2100 bioanalyzer 分析儀精確測定 RNA 完整性，對 RNA 樣品進行嚴格質控。

　　cDNA 文庫的構建：去除 RNA 樣本中的核糖體 RNA 獲得 mRNA，隨機將各組 mRNA 剪成片段，轉錄為 cDNA。在平末端和磷酸化的 cDNA 中添加一個 3' 腺苷片段和修復末端的 Illumina 接頭。采用 Illumina 高通量測序技術，對 mRNA 進行分離、純化和測序，研究脾臟組織轉錄出來的所有 mRNA。

　　生物信息學分析：利用 FeatureCounts 分析軟件統計基因原始表達量，通過過濾原始數據(raw reads)、檢查測序錯誤率和 GC 含量分布，獲得后續分析使用的 clean reads，并計算各個樣本的基因表達值，對其表達量進行標準化，組間的差異表達基因可使用包分析，并校正 P 值。其中 llog2foldchangel20 且P−adjust<0.05的基因被定義為差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)。隨后對所獲得的 DEGs 進行可視化并利用聚類方法進行分類。

　　GO(Gene Ontology，http://www.geneontology.org/)是描述基因功能的綜合性數據庫，采用 clusterProfile (3.4.4) 軟件對 DEGs 進行 GO 功能富集分析，更好地理解 DEGs 的功能，并深入了解其與疾病之間的關系。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)利用高通量數據，分析細胞、有機體和生態系統的高層次功能與作用，應用 clusterProfiler (3.4.4) 軟件對 KEGG Pathway 進行富集分析，其中P<0.05被認為是顯著的。GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)即基因集富集分析是根據兩組樣本中基因表達量數據，尋找差異表達基因，根據 Fold change 值排序，展示兩組樣本的變化趨勢，可以明顯看出兩組樣本中通路的變化情況以及通路中相關基因的表達情況。

　　1.5 定量蛋白組學技術

　　將脾臟組織樣品低溫研磨成粉，加入適量 PASP 蛋白裂解液，振蕩混勻后在冰水浴中超聲 5min 使其裂解，提取蛋白，用 Bradford 蛋白定量試劑盒對樣品蛋白質進行濃度測定，對其進行定量檢測。蛋白樣品中加入胰酶和 100mmol/L TEAB 緩沖液，混勻于酶切后加入胰酶和CaCl2酶切過夜。加入 TEAB 緩沖液復溶后加入乙腈溶解的 TMT 標記試劑，最后添加終濃度為 80mL/L 的氨水終止反應并進行除鹽處理。

　　采用 EASY - nLCTM 1200TM - UHPLC 系統液相色譜儀和 QExactiveTM HF - X 質譜儀聯用技術，進行液相色譜 - 串聯質譜聯用分析(北京諾禾致源有限公司)。使用 Proteome Discoverer 軟件對原始結果做進一步過濾，做 FDR 驗證以去除 FDR 大于 1% 的肽段和蛋白，提高分析結果質量，降低假陽性率。根據常見功能數據庫注釋結果對蛋白質進行識別，對所識別的蛋白質進行 GO 數據庫，KEGG 數據庫等功能數據庫注釋，對差異蛋白相對含量進行聚類熱圖分析和互作網絡分析等，以了解不同蛋白的功能特性。

　　1.6 非靶向代謝組學

　　于 - 80℃冰箱取出組織樣品，將 PBS 洗滌后的組織樣品 4℃、15 000×g 離心 20min 后收集上清液于 EP 管中凍存，在樣品中添加 1mL 預先冷卻的萃取物，在液氮速凍、超聲處理以及低溫孵育離心后得到代謝產物，轉移至 LC - MS 樣品瓶中進行測定。使用液質聯用(LC - MS/MS)技術檢測脾臟組織中的代謝物，使用 Compound Discoverer 3.1 軟件分析原始數據，定性定量檢測代謝物。對正、負離子模式下的代謝物進行主成分分析(PCA)，揭示樣品的概述分類，并對數據進行質量控制以保證結果的準確性和可靠度;隨后對鑒定到的代謝物進行功能和分類注釋，揭示不同代謝物差異。

　　1.7 實時熒光定量 PCR 和蛋白免疫印跡

　　實時熒光定量 PCR(RT - qPCR)步驟：將 RNA 逆轉錄為。以 β - Actin 作為內參，采用 2ΔΔCt法計算基因的相對表達量，反應體系包括 TB Green® Premix Ex Taq™ Ⅱ 10µL，ddH2O 6.4µL，cDNA 2µL，前后引物各 0.8µL。經過 45 個循環擴增，檢測 IDH3A、SUCLA2、MDH2、PGAM2、ENO3、PRPS2、PGLS、RPE 的 mRNA 表達量。

　　蛋白免疫印跡(Western blot)步驟：提取小鼠脾臟組織蛋白，并使用 BCA 法對所提取蛋白進行濃度測定，調整每孔上樣量為 30µg。加樣后進行 SDS - PAGE 電泳(恒壓 90V)和轉膜(恒流 200mA)。使用 TBST 洗液將 NC 膜清洗一次后，在室溫下用無蛋白快速封閉液封閉 NC 膜 10min。加入相應稀釋倍數的一抗 IDH3A (1:500)、SUCLA2 (1:1 000)、MDH2 (1:500)、PGAM2 (1:500)、ENO3 (1:5 000)、PRPS2 (1:500)、PGLS (1:500)、RPE (1:500)、β - actin (1:10 000)，在 4℃孵育過夜。第二天使用 TBST 洗液洗膜(5min / 次，6 次 + 10min / 次，1 次)后，分別加入相應的羊抗兔二抗(1:5 000)或羊抗鼠二抗(1:5 000)，于室溫下孵育 1h。再次洗膜(6min / 次，5 次)后，用 ECL 化學發光液進行顯色，使用法國 VILBER Fusion solo 成像分析系統成像分析。

　　1.8 統計學方法

　　數據分析使用 SPSS 18.0 軟件和 GraphPad Prism8.4.0 軟件，符合正態分布的計量資料采用xˉ±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本 t 檢驗，非正態性分布數據采用秩和檢驗。

　　P<0.05為差異有統計學意義。所有實驗都是獨立重復 3 次。

　　2 結果

　　2.1 小鼠脾臟指數檢測

　　低氧暴露 30d 后，測量小鼠體質量，無菌采集小鼠脾臟組織并測量其質量，計算小鼠脾臟指數。發現小鼠脾臟質量較平原常氧顯著減少 I$ (P<0.0001)$)。HST 組較 PSC 組小鼠體質量顯著下降 ((P<0.0001))，脾臟指數降低 ((P<0.001))。結果表明，高原低氧環境刺激下小鼠脾臟組織重量減少。

　　2.2 小鼠脾臟組織病理學檢測

　　在組織學分析 H&E 染色結果顯示，HST 組小鼠脾臟組織白髓減少，生發中心范圍擴大，分界模糊，并伴有靜脈充血;此外，可見部分細胞凋亡、核固縮、核碎裂等。提示，高原低氧環境下小鼠脾臟組織發生炎癥性病理學改變。

　　2.3 轉錄組測序分析

　　飼養 30d 后，采集小鼠脾臟組織，通過雙端測序法分別測序 PSC 組和 HST 組的 5 個生物學重復樣本，構建文庫，每個樣本都含有成千上萬個基因，對這些基因計算表達量值(FPKM)，應用 PCA 對整體數據降維，簡化數據，評價生物學重復的好壞，點之間的距離即代表著樣本之間的相似程度。PCA 結果顯示組內樣本聚集，組間樣本相對分散，說明本次轉錄組測序數據質量較高，可用于后續分析。

　　小鼠脾臟組織轉錄組測序分析 PSC 組和 HST 組共檢測出個基因，以且P−adjust<0.05作為 DEGs 的篩選閾值，共鑒定出 4213 個 DEGs，其中 1947 個基因表達上調，2266 個基因表達下調。為了分析 DEGs 在不同實驗條件下的生物學功能、細胞組分和分子功能，對富集到的 4213 個 DEGs 做了 GO 注釋分析，發現差異表達基因顯著富集在 B 細胞活化、氧化應激、氧化磷酸化等生物過程，免疫球蛋白復合體、呼吸鏈、ATP 酶復合體等細胞組分，以及 GTP 酶復合體等分子功能。對 DEGs 進行 KEGG 分析，對 KEGG 通路進行分類匯總，結果顯示，碳代謝、氧化磷酸化、脂肪酸代謝等通路顯著富集。提示機體碳代謝、能量代謝等在高原低氧脅迫下發生了重要變化。

　　2.4 蛋白質組學數據處理與分析

　　以 FC≥1.2，P−value<0.05為篩選閾值，篩選上調表達蛋白，以FC≤0.83，P−value<0.05為篩選閾值，篩選下調表達蛋白。對 PSC 組和 HST 組差異表達蛋白(DEPs)分析，發現 166 個蛋白表達上調，39 個蛋白表達下調。

　　對 PSC 組和 HST 組每個樣品中關鍵差異蛋白相對含量進行聚類分析，利用聚類熱圖觀察不同蛋白在組間比較時的上調、下調情況。對各樣本差異蛋白的表達水平進行層次聚類分析。結果顯示，同一蛋白分子在 PSC 組和 HST 組表達不同。提示，高原低氧暴露下小鼠脾臟組織中蛋白分子發生重要改變。

　　為了解差異蛋白在低氧脅迫下的生物學功能，對富集到的差異蛋白進行 GO 注釋分析和 KEGG 富集分析，GO 注釋分析結果顯示，蛋白質磷酸化、氧化還原過程、代謝過程等在 BP 中富集，在 CC 中膜成分、核糖體、線粒體等細胞組分活性較強，在 MF 中 GTP 合成、ATP 合成及蛋白激酶活性顯著富集。KEGG 結果顯示，DEPs 參與碳代謝、脂肪酸代謝等途徑。提示高原低氧條件下碳代謝通路發生了重要改變。

　　2.5 非靶向代謝組學分析

　　采用 PCA 的方法，觀察 PSC 組和 HST 組樣本之間的總體分布趨勢。PCA 結果顯示正負離子模式下，組間樣本均分散，組內樣本均相對聚集，說明代謝組學測序結果可靠，可用于后續分析。

　　火山圖可直觀顯示差異代謝物的變化情況，設定篩選閾值為 VIP > 1.0，FC >1.5 或 FC <0.667 且 P - value<0.05，繪制火山圖分析發現在正負離子模式下共有 95 種代謝物上調，38 種代謝物下調。

　　通過 KEGG 富集確定差異代謝物參與的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。對差異代謝物進行 KEGG 富集分析發現，差異代謝物參與能量代謝、碳水化合物代謝等碳代謝相關途徑。同樣提示高原低氧條件下碳代謝通路發生了重要改變。

　　2.6 碳代謝通路的 GSEA 與 KEGG 富集分析

　　由于轉錄組測序、蛋白質組學以及非靶向代謝組學中 GO 和 KEGG 富集分析結果均與碳代謝相關，因此，本研究重點關注了碳代謝通路。為了分析碳代謝通路在高原低氧條件下的變化，對其進行 GSEA 富集分析，發現基因集富集分數(enrichment score，ES)小于 0，hits 圖標記了通路基因集中的基因在 PSC 組富集，且 rank 在列表的尾端也表示基因在 PSC 組樣本中表達量高，說明碳代謝通路在高原低氧脅迫下被抑制。對碳代謝通路具體分析，碳代謝通路 KEGG 富集圖，本研究重點關注了糖酵解途徑(embden - meyerhof - parnas，EMP)，磷酸戊糖途徑(pentose phosphate ，PPP)，三羧酸循環(tricarboxylic acid，TCA)3 條途徑。

　　2.7 碳代謝通路驗證

　　采用 RT - qPCR 和 Western blot 技術檢測碳代謝通路中關鍵基因和蛋白。結果顯示，EMP 中 PGAM2、ENO3 的 mRNA 表達量和蛋白表達量呈現下調趨勢，PPP 中 PRPS2、PGLS、RPE 的 mRNA 表達量和蛋白表達水平呈現下調趨勢，TCA 中 IDH3A、SUCLA2、MDH2 的 mRNA 表達量和蛋白表達水平均顯著下調，以上結果表明低氧暴露抑制了小鼠脾臟組織中碳代謝通路中的 EMP、PPP 以及 TCA，其關鍵蛋白下調表達會導致 ATP 生成減少，能量代謝發生紊亂。

　　3 討論

　　低氧脅迫會影響機體的免疫功能、導致炎癥反應、氧化應激、脂代謝失衡等一系列變化，課題組已有多項研究表明，HIF - 1α 在缺氧條件下表達上調，ROS 產生增多 [12 - 13]，誘導線粒體損傷，細胞功能障礙，導致急進高原人群可能會罹患急性高山病、高原腦水腫、高原肺水腫等 [14 - 15]。本研究通過構建高原低氧小鼠模型發現，相較于 PSC 組，HST 組小鼠脾指數降低;脾臟組織病理學顯示，HST 組小鼠脾臟組織白髓減少、生發中心擴大，邊緣區模糊并伴有靜脈充血，提示高原低氧暴露 30d 后小鼠脾臟組織發生了重要病理性改變。但目前對其變化機制的研究尚少，因此，本實驗通過轉錄組測序、蛋白質組學、非靶向代謝組學進一步分析 DEGs、DEPs 和 DEMs，旨在深入了解高原低氧條件下小鼠脾臟組織變化的分子機制。

　　為了深入了解高原低氧條件下小鼠脾臟組織中發生改變的關鍵通路，通過轉錄組測序，發現高原低氧條件下小鼠脾臟組織中共發現了 4213 個 DEGs，其中 1947 個基因表達上調，2266 個基因表達下調;通過蛋白質組學測序分析發現高原低氧條件下共有 166 個蛋白表達上調，39 個蛋白表達下調;此外，非靶向代謝組學分析發現正、負離子模式下共有 95 個代謝物上調，38 個代謝物下調。進一步對這些 DEGs、DEPs 和 DEMs 進行 KEGG 富集分析，結果顯示共同富集到碳代謝通路。

　　碳代謝是細胞和組織中普遍存在的代謝過程，包括 EMP、PPP 以及 TCA 等過程，是細胞生長和發育的主要能量來源，并為其他代謝活動提供前體物質 [16]。研究發現，為了應對全身性缺氧，中性粒細胞重組其蛋白質組并增強細胞外蛋白質清除，從清除的蛋白質中釋放氨基酸，從而維持中心碳代謝 [17]。而本研究通過 GSEA 富集分析發現高原低氧條件下碳代謝通路被明顯抑制，這與之前的研究報道腫瘤中缺氧微環境誘導中心碳代謝重編輯一致。機體中心碳代謝異常會導致線粒體功能障礙 [18]，機體對營養物質的消化、吸收、排泄等出現病理性不平衡狀態，容易導致各種疾病的發生，如高血壓、高血糖、高血脂、高尿酸癥等代謝性疾病、神經系統疾病和癌癥等 [19 - 21]。為了探究低氧脅迫導致碳代謝異常的分子機制，本研究選取了碳代謝通路 3 條經典途徑中 PGAM2、ENO3、PRPS2、PGLS、RPE、IDH3A、SUCLA2、MDH2 8 個關鍵基因和蛋白進行 mRNA 和蛋白表達量檢測，發現低氧暴露 30d 后，HST 組較 PSC 組，基因和蛋白表達量均下調。

　　EMP 途徑是將葡萄糖在一系列酶的催化下分解為丙酮酸并產生能量的過程。機體組織細胞在有氧和無氧條件下均可通過 EMP 途徑來獲得能量。磷酸甘油酸變位酶 2(PGAM2)是 EMP 途徑中的一種重要酶，可催化磷酸基團從 3 - 磷酸甘油酸轉移到 2 - 磷酸甘油酸 [22]。PGAM2 可以在協調通過 EMP 產生的能量、產生的還原力、生物合成氨基酸、5 - 碳糖(用于合成 RNA 和 DNA 的核苷酸的前體)的能量產生等方面發揮作用。烯醇化酶(ENO3)是一種二聚體酶，可將 2 - 磷酸甘油酸烯醇化為磷酸烯醇式丙酮酸，進而轉化為丙酮酸，作為 EMP 途徑的一部分。本次 RT - qPCR 實驗和 Western blot 實驗結果均顯示低氧刺激導致 PGAM2、ENO3 表達下調，提示高原低氧脅迫會導致 EMP 途徑發生改變。

　　PPP 由葡萄糖直接氧化起始，產生大量的 NADPH，為細胞的各種合成反應提供還原劑，在細胞營養代謝和大分子生物合成方面起著至關重要的作用 [23]。磷酸核糖焦磷酸合成酶 2(PRPS2)是一種限速酶，具有鎂離子結合活性、嘌呤核苷酸結合活性、核糖磷酸二磷酸激酶活性，參與 5 - 磷酸 2 - 磷酸生物合成過程。PRPS2 不僅是嘌呤生物合成酶，也是偶聯蛋白和核苷酸生物合成的限速酶。有報道稱，PRPS2 介導的嘌呤代謝與缺氧、先天免疫應答、腫瘤葡萄糖剝奪以及維持腦腫瘤起始細胞有關 [24]。6 - 磷酸葡萄糖酸酯酶(PGLS)是磷酸戊糖途徑的關鍵酶，可水解 6 - 磷酸 - δ - 葡萄糖酸內酯生成 6 - 磷酸葡萄糖酸(6PG)。有研究表明，核糖 - 5 - 磷酸 - 3 - 差向異構酶(RPE)催化核酮糖 - 5 - 磷酸和木酮糖 - 5 - 磷酸的相互轉化，參與細胞碳水化合物代謝過程、磷酸戊糖分解代謝過程 [25]。本研究中，與 PSC 組相比，HST 組 PRPS2、PGLS、RPE 的基因和蛋白表達水平均呈現下調趨勢，提示高原低氧環境下 PPP 途徑被抑制。

　　TCA 循環是碳水化合物、脂肪、氨基酸等的最終共氧化過程，TCA 的中間產物是表觀遺傳修飾的重要底物，在多種結構中表達，為許多生物合成途徑提供前體物質。異檸檬酸脫氫酶 3(IDH3A)將異檸檬酸氧化脫羧生成 α 酮戊二酸，是循環中的限速酶，IDH3A 位于線粒體和髓鞘中，在多種結構中表達，包括消化系統、中樞神經系統、泌尿生殖系統、呼吸系統、和感覺器官。有研究表明，IDH3A 活性降低導致視網膜變性和線粒體功能降低 [26]。線粒體功能障礙可引起氧化應激甚至導致細胞死亡 [21]。琥珀酸輔酶 A 連接酶(SUCLA2)催化琥珀酰輔酶 A 轉化為琥珀酸，具有穩定線粒體核苷酸二磷酸激酶的功能，ALKHATER 等人發現 SUCLA2 突變是導致腦肌病和線粒體 DNA 耗竭的原因之一 [27]。蘋果酸脫氫酶 2(MDH2)被稱為典型的 NAD + 依賴性脫氫酶 [28]，已有研究證實，與輔酶 NADH 或 NAD + 結合后將蘋果酸催化為草酰乙酸，MDH2 在膿毒性急性肺損傷組織中表達顯著降低 [29]。本研究 HST 組 IDH3A、SUCLA2、MDH2 基因和蛋白表達水平均明顯低于 PSC 組，提示高原低氧脅迫會導致 TCA 循環受到抑制。

　　低壓低氧環境是影響新陳代謝的關鍵因素之一，新陳代謝受到正常細胞營養吸收和代謝的嚴格調控，葡萄糖作為細胞的主要能量來源，對細胞生理學至關重要 [30]。碳代謝是產生能量的重要途徑，對機體能量代謝活動至關重要，是維持生物體細胞生長最基本的代謝活動，以上研究表明，低氧脅迫會導致碳代謝通中關鍵基因和蛋白表達下調，提示高海拔地區會導致哺乳動物碳代謝通路受到抑制，進而使機體能量代謝發生紊亂。

　　綜上所述，本研究通過轉錄組測序、蛋白質組學和非靶向代謝組學測序分析發現高原低氧脅迫下大量與碳代謝通路相關的 DEGs、DEPs 和 DEMs，通過 KEGG 富集分析發現 DEGs、DEPs 和 DEMs 在碳代謝、能量代謝、氧化磷酸化等通路顯著富集，在 GO 注釋分析中也發現了類似結果。隨后，通過 RT - qPCR 和 Western blot 檢測發現碳代謝通路中 PGAM2、ENO3、PRPS2、PGLS、RPE、IDH3A、SUCLA2、MDH2 等關鍵基因和蛋白表達水平下調，提示高原低氧條件抑制碳代謝通路，導致機體代謝失衡、氧化損傷。本研究豐富了高原低氧條件下機體碳代謝發生改變的分子機制，為低氧脅迫下能量代謝紊亂提供了新的理論依據。

陳曉晨;胡 英;許玉珍;龍啟福;馬茹雪;永 勝,青海大學醫學院基礎醫學部免疫學教研室,202405