1 材料與方法

　　1.1 實驗材料

　　本研究所用菌種及質粒見表 1。LB(Luria-Bertani)培養基用于大腸桿菌和嗜水氣單胞菌的培養，購自賽默飛世爾科技公司;綿羊血瓊脂平板購自北京索萊寶科技有限公司;限制性內切酶(EcoR I、Xba I 和 Hind Ⅲ)、T4 DNA 連接酶、DNA Marker、FastPure Plasmid Mini Kit 質粒小量提取試劑盒，均購自 Takara 公司;基因組提取試劑盒，購自全式金有限公司;瓊脂糖，購自 Promega 公司;Agar Powder，購自 Solarbio 公司;Gel Extraction Kit，購自 OMEGA 公司。氨芐青霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)貯存液終質量濃度為 100 mg/mL。BALB/c 小鼠購自河北醫科大學動物中心。本研究所用引物由金唯智生物技術公司合成。

　　1.2 實驗方法

　　將嗜水氣單胞菌接種于 LB 液體培養基中，30 ℃、180 r/min 過夜培養;4 500 r/min 離心 10 min，棄上清，收集菌體。根據 TRIzol® 試劑盒說明書提取 A.hydrophila 的總 RNA，使用 Nanodrop1000 微量紫外分光光度計(賽默飛世爾科技公司)和 1% 瓊脂糖凝膠電泳測定 RNA 的質量濃度(ng/μL)、純度((OD260/OD28))和片段大小，利用 Agilent 5400 片段分析儀(Agilent Technologies 有限公司)測定 RNA 完整性值(RIN)。確定 RNA 濃度是否滿足建庫測序質量要求。

　　RNA 文庫構建、質控和測序：原核生物轉錄組測序采用去除 rRNA 鏈特異性的建庫方式，嚴格要求測序數據質量(Q20>90%，Q30>85%);庫檢合格后，用 NovaSeq 6000 測序平臺(美國 Illumina 公司)進行高通量測序，測序讀長為 PE150。

　　轉錄組測序數據分析：首先對測序數據質量進行評估，過濾低質量數據，保證數據質量，與嗜水氣單胞菌參考基因組進行比對，分析對比率;其次對樣本的基因表達水平進行分析來評估該樣品中基因的表達量;最后基于以上標準分析，對該樣品進行原核轉錄組的高級分析。分析主要包括 SNP/Indel 分析變異位點、挖掘新的基因或轉錄本、對操縱子、轉錄起始位點和終止位點等基因結構分析以及對 5′UTR SD 序列預測和 3′UTR 終止子序列預測，此外分析該樣品反義轉錄本在基因組上的位置、種類以及數量等。將經過組裝的測序結果與已注釋的基因模型進行比較，應用 Rockhopper 軟件發現新的基因區間轉錄本，通過 Blastx 與 nr 庫作比對，對新預測的轉錄本區域進行注釋，將注釋不上的轉錄本作為候選的非編碼 sRNA。

　　對預測出的 sRNA 進行二級結構預測和靶基因預測。用 TargetRNA 2.01 軟件(https://cs.wellesley.edu/~btjaden/TargetRNA2/index.html)對候選的 sRNA 的靶基因進行預測，以 Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966 chromosome 作為數據庫。利用 BLAST 挖掘其他物種中的 sRNA，然后使用 ClustalX 軟件和 GenDoc 軟件進行多序列比對，分析 sRNA 在不同物種中的保守性。

　　37 ℃、180 r/min 過夜培養復蘇菌液后提取 A.hydrophila 基因組。以基因組 DNA 為模板，分別用 P1FP1-R 和 P2-FP2-R 引物進行 PCR，擴增 sRNA 上游同源臂(660 bp)和下游同源臂(880 bp)。反應程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，35 個循環，72 ℃總延伸 10 min，4 ℃停止反應?；厥漳康钠?，分別通過限制性酶切位點 EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ 和 Hind Ⅲ 與 pMD19-T 克隆載體連接，構建得到質粒 pMD-sRNA-up 和 pMD-sRNA-down。將測序正確的質粒 pMD-sRNA-up/down 和敲除載體 pK18mobsacB 用限制性內切酶(EcoR Ⅰ 和 Xba Ⅰ)進行雙酶切，并連接構建得到重組質粒 pKARD。

　　將 pKARD 電轉入嗜水氣單胞菌感受態細胞中，涂布于含有 Kan 的平板上，將生長的單菌落分別劃線在編號相同的 Kan 抗性平板和含有 10% 蔗糖的 Kan 抗性平板(Kan+ZT)上。接著挑取在 Kan 平板上生長在 Kan+ZT 平板上不生長或者生長能力較弱的單菌落，即為單交換菌株。將篩選出的單菌落接種在 LB 液體培養基中過夜培養，將菌液梯度稀釋后涂布于只含有 10% 蔗糖的平板上(ZT)，將 ZT 平板上長出的單菌落分別劃線在編號相同的 ZT 平板和 Kan 抗性平板上，挑選在 ZT 平板上生長且在 Kan 抗性平板上不生長的菌株，提取該菌株基因組 DNA，利用引物 sRNA-del-F/R 進行 PCR 并測序驗證，得到 sRNA 缺失突變體。

　　(1) 生長曲線測定：取嗜水氣單胞菌野生菌株(WT)和 sRNA 缺失菌株(△sRNA)接種于 LB 培養基中，30 ℃、180 r/min 過夜培養。在無菌條件下，取 0.1 μL 的菌液和 300 μL 的 LB 液體培養基以每組設 5 個平行的標準接種于 96 孔板中，用 Bioscreen 生長曲線測定儀(德國 Bioscreen 公司)設置生長條件為 30 ℃、220 Hz 頻率，連續培養 40 h，每隔 1 h 測 1 次OD600值。

　　(2) 運動能力測定：配制瓊脂質量分數分別為 0.5%(集群運動，swarming)和 0.35%(泳動，swimming)的固體 LB 培養基。取野生型和△sRNA 接種于 LB 液體培養基，振蕩培養至OD600​值為 1。吸取 2 μL 菌液分別加至不同瓊脂濃度的固體培養基中心，正置于 37 ℃恒溫培養箱培養 48 h 后觀察菌落直徑，每個樣品重復 3 次。

　　(3) 滲透壓穩定性測定：取 WT 和△sRNA 菌株，30 ℃、180 r/min 條件下培養至OD600​值為 1。取 0.1 μL 菌液接種于 96 孔板中，分別用 300 μL 含 2% 和 4% NaCl 的 LB 液體培養基進行培養，每組設置 5 個平行，用 Bioscreen 生長曲線測定儀設置生長條件為 30 ℃、220 Hz 頻率，連續培養 40 h，每隔 1 h 測定 1 次OD600值，生長條件參照 1.2.5 (1)。

　　(4) 溶血能力測定：利用滅菌棉簽蘸取過夜培養的野生型和△sRNA 突變株，劃線至 4% 綿羊紅細胞血平板上，倒置于 37 ℃恒溫培養箱中培養，48 h 后觀察其溶血現象，每個樣品重復 3 次。

　　(5) 蛋白酶活測定：將野生型和△sRNA 菌株在 30 ℃、180 r/min 條件下培養至OD600值為 0.6，離心后將上清液通過 0.22 μm 的 MCE 膜過濾。以 1 mL 偶氮酪蛋白(50 mmol/L 的 Tris-HCl 中終質量濃度為 3 mg/mL，pH 值為 7.5)為底物加入 200 μL 上清液中，37 ℃孵育 30 min 后加入預冷的 10% 三氯乙酸終止反應。離心收集上清后分別加入 96 孔板中并用 1 mol/L 的氫氧化鈉中和，使用酶標儀測定 400 nm 處吸光度，確定酶活力。

　　(6) 生物被膜形成能力測定：將過夜培養的OD600值為 0.1 的野生型和△sRNA 菌液分別加入到 24 孔板中，每孔 600μL，用 LB 液體培養基作為空白對照。將 24 孔板放在 30 ℃恒溫培養箱中培養 48 h，吸去菌液，用 PBS 清洗 2 遍去除浮菌，加入 600 μL 甲醇固定 30 min。用ddH2O清洗，然后烘干固定。每孔加入 600 μL 質量分數為 1% 的結晶紫染液，室溫染色 10 min 后棄去染液，用 PBS 清洗孔板至澄清狀態，最后烘干 30 min，觀察生物被膜形成情況。為了進一步測定 2 種菌株的生物被膜產量，向 24 孔板的每孔中加入 600 μL 體積分數為 33% 的冰醋酸溶解結合在生物被膜上的染料，酶標儀測量 595 nm 波長下的吸光度，每組設 3 個重復。

　　(7) 藥物敏感性測定：將野生型和△sRNA 菌株于 LB 液體培養基中過夜培養，用 PBS 緩沖液將菌液稀釋成合適濃度的菌懸液并用無菌棉簽涂布到 LB 固體培養基上，然后在固體培養基表面放置制作好的 20 種抗生素的藥敏紙片。于 30 ℃恒溫培養 16 - 24 h，并對其抑菌圈的直徑進行測量，每組實驗 3 個平行。根據抑菌圈直徑大小判斷藥物的敏感性程度，判斷標準參考文獻 [15]。

　　(8) 小鼠半致死劑量的測定：將 20 只馴養 7 d 的體質量為 25 g 的 BALB/c 小鼠平均分成 4 籠，每籠 5 只。將 4 籠小鼠再隨機分為 2 組：野生型組(2 籠小鼠)、△sRNA 組(2 籠小鼠)。將野生型和△sRNA 菌株接種于 LB 液體培養基中，30 ℃、180 r/min 培養至相應 CFU 所對應OD600值;5 000 r/min、2 min 收集菌體，用 PBS 分別進行梯度稀釋，以備腹腔注射用。小鼠腹腔注射菌液后，定時觀察并記錄小鼠的死亡情況。

　　1.3 統計分析

　　本研究的差異統計學意義檢驗采用單因素方差分析(ANOVA)，∗P<0.05表示差異具有統計學意義，∗∗P<0.01表示差異具有高度統計學意義，用 GraphPad Prism 7 軟件作圖。

　　2 結果與分析

　　2.1 嗜水氣單胞菌轉錄組測序分析

　　使用 Illumina 測序平臺進行嗜水氣單胞菌 A.hydrophila ATCC 7966 的轉錄組測序，共獲得原始測序序列(raw reads)17 395 644，對原始測序序列進行過濾，除去帶接頭的、低質量的 reads 后得到的 Clean reads 為 16 970 198，Clean bases 為2.55x10;Q20 堿基百分比為 97.77%，Q30 堿基百分比為 93.66%，表示堿基識別率的正確度較好。堿基 G 和 C 的數量總和占總堿基數量的百分比為 53.39%。結合各項評估數據顯示，測序數據較理想，可靠性較高。

　　2.2 嗜水氣單胞菌中非編碼 RNA 分析

　　在本樣品中預測得到 4 個 sRNA，其位置、長度及表達水平如表 3 所示。通過 RNAfold 軟件對候選的 sRNA 進行二級結構預測。對篩選得到的 4 個 sRNA 進行進一步分析，其中 sRNA04(序列包含有 sRNA03)基因長度最長，而且表達水平最高，FPKM 值最大，因此對其進行后續研究。

　　通過序列檢索發現，sRNA04 位于 A.hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966 基因組中 AHA_4096 和 AHA_4097 之間的基因間隔區(intergenic region，IGR)。AHA_4096 基因預測編碼 CopG 家族轉錄調控因子(CopG transcriptional regulator)，AHA_4097 基因預測編碼甲基接收趨化蛋白(methyl-accepting chemotaxis protein)。使用 TargetRNA 2.01 軟件對候選 sRNA 的靶基因進行預測，篩選到序列特異性P<0.05的目的性靶基因 77 種。

　　2.3 sRNA 序列保守性分析

　　通過 NCBI BLAST 搜索分析 sRNA 的核酸序列，Max target sequences 設為 5 000，發現 sRNA 具有較強的物種特異性，僅存在于氣單胞菌屬中。通過對嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)、動物氣單胞菌(Aeromonas bestiarum)、中間氣單胞菌(Aeromonas media)、達卡氣單胞菌(Aeromonas dhakensis)和殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)的多序列比對分析發現，sRNA 在 5 種氣單胞菌中高度保守，序列一致性均高于 99%。

　　2.4 嗜水氣單胞菌的 sRNA 基因缺失突變體(△sRNA)的構建

　　為了進一步研究嗜水氣單胞菌中 sRNA 的生理功能，本研究構建了 sRNA 基因缺失突變體(△sRNA)。首先構建了基因缺失重組質粒 pKARD。泳道 1 是重組質粒 pKARD 的三酶切結果，得到大小約為 5 200 bp 的載體條帶、sRNA 上游基因(660 bp)和下游基因(880 bp)條帶;泳道 2、3 是重組質粒 pKARD 的雙酶切結果，分別獲得載體、sRNA 上游基因和 sRNA 下游基因。實驗結果證明重組質粒 pKARD 構建成功。△sRNA 的構建：泳道 1 是用 sRNA-del-F/R 引物以野生型菌株的基因組 DNA 為模板進行 PCR 的產物，大小為 804 bp;泳道 2、3、4 是用 sRNA-del-/R 引物以 sRNA 敲除菌株的基因組 DNA 為模板進行 PCR 的產物，大小為 563 bp。野生型菌株與敲除菌株的產物大小相差 241 bp，與預期值相符，進一步測序比對驗證了結果的可靠性。上述結果證實本研究成功構建了敲除菌株△sRNA。

　　2.5 sRNA 生物特性分析結果

　　為了檢測 sRNA 缺失是否會影響嗜水氣單胞菌菌株的生長，本研究測定了野生型菌株與 sRNA 敲除菌株持續 40 h 的生長曲線，野生型菌株與△sRNA 菌株的倍增時間均在 15 h，生長穩定期的OD600值約為 1.85，生長速率無明顯差異，表明 sRNA 缺失不直接影響嗜水氣單胞菌的生長。

　　細菌泳動和集群運動是以鞭毛為導向的運動行為，可在半固體環境中檢測，同時細菌的運動能力也與病原菌的致病性密切相關。對野生型和△sRNA 菌株進行運動能力檢測，sRNA 缺失后在 0.35% 和 0.50% 半固體 LB 平板泳動的直徑分別為 25.0 mm 和 21.5 mm，與野生型的運動能力無明顯差異。

　　不同滲透壓下野生型菌株和△sRNA 菌株的生長情況，野生型和△sRNA 菌株在高滲環境下的生長曲線大致相同，當 NaCl 質量分數為 2% 時，生長平臺期OD600值為 1.45，相比正常鹽質量分數(OD600值為 1.85)培養下減少 0.4;當 NaCl 質量分數為 4% 時，生長平臺期OD600值為 1.02，相比正常鹽質量分數(OD600值為 1.85)培養下減少 0.83。這說明在高滲透壓條件下野生型和△sRNA 菌株的生長均受到抑制，且隨著滲透壓的升高，抑制效果越明顯，野生型和△sRNA 菌株受抑制的程度沒有明顯差異。

　　2.5.4 對嗜水氣單胞菌溶血活性及蛋白酶活性的影響

　　溶血特性與蛋白酶活力是嗜水氣單胞菌重要的致病因子，為了探索 sRNA 是否會對致病性嗜水氣單胞菌的溶血活性和蛋白酶活性產生影響，利用含有 4% 綿羊紅細胞的血平板對菌株的溶血活性進行測定，并檢測蛋白酶活性。結果顯示，野生型和△sRNA 菌株均能產生明顯的溶血現象，沒有顯著差異。而野生型的蛋白酶活性顯著高于△sRNA 菌株的活性，差異具有統計學意義((P<0.01))。

　　2.5.5 對生物被膜形成能力的影響

　　通過測定OD595來評估野生型和△sRNA 菌株的生物被膜形成能力，結果表明，野生型菌株具有較強的生物被膜形成能力，sRNA 菌株生物被膜形成能力顯著降低((P<0.01))。

　　2.5.6 藥物敏感性測試結果

　　藥敏測試結果顯示，與野生型相比，△sRNA 菌株對青霉素和紅霉素的敏感性增強，對鏈霉素的敏感性減弱，對其他 17 種抗生素的敏感性與野生型一致。其中，野生型菌株對青霉素耐藥，但△sRNA 菌株對青霉素轉為中度敏感，這提示 sRNA 的功能可能與青霉素敏感性有關。

　　2.5.7 sRNA 對小鼠的致病性評價

　　嗜水氣單胞菌是一種條件致病菌，為了探究 sRNA 是否直接影響其致病性，分別向小鼠體內注射 3 種不同劑量的野生型和△sRNA 菌株，分別為4.5×107、3.0×107和1.5×107CFUs。感染野生型菌株劑量為3.0×107CFU的小鼠表現出厭食、抑郁、虛弱、眼球和屁股出血等臨床癥狀，24 h 內死亡率為 40%，48 h 內死亡率達到 80%。感染野生型菌株劑量為1.5×107CFUs的小鼠 48 h 內死亡率為 40%，臨床癥狀較輕。感染△sRNA 菌株劑量為1.5×107CFUs的小鼠 48 h 內死亡率為 20%，幾乎沒有表現出臨床癥狀。統計小鼠的死亡率，△sRNA 菌株對小鼠的LD50值(2.1×107CFUs)是野生型菌株(1.7×107CFUs)的 1.23 倍。以上結果表明 sRNA 基因缺失菌株較野生型的致病性有所降低。

　　3 討論與結論

　　非編碼小 RNA(sRNA)在細菌的整個生命活動中起著重要的調控作用，主要是幫助細菌快速感知并適應環境變化、調控細菌代謝、控制群體感應和生物被膜形成以及調控毒力基因表達和細菌致病力。本研究基于嗜水氣單胞菌的轉錄組測序數據，預測得到 4 個非編碼 RNA，以其中一段 sRNA 為研究對象，構建得到 sRNA 基因缺失突變體(△sRNA)，并對△sRNA 的生理特性和致病性進行分析。

　　研究顯示，敲除 sRNA 基因后，突變體的生物被膜形成能力顯著下降，表明 sRNA 的敲除對嗜水氣單胞菌生物被膜形成具有顯著的抑制作用。細菌生物被膜的形成是一個復雜的生理過程，是細菌適應環境的重要機制。以往研究證實，sRNA 在生物被膜形成過程中起著重要的調控作用。Andreassen 等研究發現，sRNA 通過影響大腸桿菌形成生物被膜的關鍵轉錄因子 CsgD 的表達，從而影響其生物被膜的形成;Falcone 等研究發現，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和腸炎沙門菌(Salmonella enteritidis)中有多種 sRNA，可通過調控與生物被膜形成相關的蛋白質影響細菌生物被膜的形成。

　　革蘭氏陰性菌細胞壁外膜上存在外膜蛋白(OMPs)，這種蛋白是細菌適應生存環境所必需的，具有良好的免疫原性，如霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)中某些 sRNA 可以抑制外膜蛋白的合成。此外 sRNA 還會影響細菌體內許多蛋白質的合成，改變細胞必須的營養物質，如細菌代謝所必須的鐵離子，它是細胞內許多生化反應重要的輔助因子，細菌中某些 sRNA 對鐵代謝過程中多個基因的表達都具有調控作用。如大腸桿菌中的 sRNA - RhyB，它能夠調節鐵吸收調節蛋白(Fur)，RhyB 是細菌感受環境中鐵離子濃度下降時表達的一種 sRNA，當 RhyB 表達時，它能夠與需鐵蛋白的 mRNA 部分序列結合，降低 mRNA 的穩定性和轉錄效率，減少需鐵蛋白合成，從而維持細菌細胞內部的鐵穩態。

　　嗜水氣單胞菌 sRNA 基因的缺失降低了菌體的生物被膜形成能力、蛋白酶活性和致病性，但是對菌體的生長能力、運動能力、溶血能力以及對高滲環境的適應能力沒有顯著影響。宋婷等的研究也發現，短小芽孢桿菌非編碼 RNA 基因缺失突變體在生長曲線和胞內蛋白表達方面與野生型菌株無顯著差異。因此本研究推斷 sRNA 可能通過影響嗜水氣單胞菌的生物被膜形成從而影響其致病能力。

　　針對 sRNA 的功能本研究對 sRNA 基因的處理方式還存在不足。在后續工作中，一方面可以嘗試上調 sRNA 基因的表達量，國外有研究表明，在致病性金黃色葡萄球菌中誘導非編碼 RNA - sprC 的表達會導致該菌的致病性減弱;另一方面，sRNA 通常是細菌受到脅迫的環境下產生的調控因子，可能在特定的生理功能中影響到細菌表型的變化，這些在本研究中還未涉及。

王嘉璐;蔡彤璇;陳甜夢;李 娜;劉瑤瑤;趙寶華;劉 東,河北師范大學生命科學學院,202501