哺乳動物的海馬可參與包括學習和記憶過程在內的多種高級腦功能。研究顯示：海馬參與不同種類的學習與記憶形成過程，如空間學習、物體識別和厭惡性動機學習等，尤其在各種回避性學習中海馬是必不可少的。海馬主要由 CA1~CA3 和齒狀回(dentate gyrus，DG)構成，每個亞區在學習記憶中有不同的作用，而 DG 區作為新信息進入海馬的傳入點在海馬的學習記憶功能中起關鍵作用。突觸效應的長時程增強(longterm potentiation，LTP)是中樞神經系統中突觸可塑性的典型表現，是海馬依賴性學習過程的重要神經生理學機制 ，而將學習記憶中出現的、與學習記憶能力間存在平行關系的 LTP 樣變化稱之為 “習得性 LTP”(learning-dependent LTP，LD L.TP)。

　　在產生和維持海馬 LTP 的過程中，谷氨酸(glutamate，Glu)及其受體是主要的突觸傳遞承擔者 ，同時，海馬 LTP 也受幾種腦干上行神經遞質系統的調節，其中包括來自中腦的多巴膠(dopamine，DA)系統 。DA 是中樞神經系統中重要的單胺類神經遞質，參與調節運動控制、認知、情感、攝食和內分泌等多種生理功能，腦內 DA 還在恐怖記憶等多種記憶形成過程中也起重要的調節作用 。DA 通過其膜受體發揮作用，目前已分離出的 DA 受體有 5 種，即 D1~D5 受體。研究顯示：海馬 DG 區有 DA 能神經元的分布和 D1 受體的表達，而且 DG 區的 D1 受體可調節顆粒細胞的突觸可塑性，但是海馬 DG 區的 DA 及其 D1 受體在大鼠主動回避學習中的作用少有報道。因此，本實驗在大鼠主動回避條件反射的建立以及消退過程中，觀察大鼠海馬 DG 區細胞外液中 DA 水平變化，并結合向 DG 區微量注射 D1 受體阻斷劑，觀察 DA 水平對主動回避學習記憶中 DG 區 Glu 釋放和突觸傳遞效應的影響，進一步探討海馬 DG 區 DA 及其 D1 受體在大鼠主動回避學習中的作用及其機制。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗動物、主要試劑和儀器

　　選擇處于成年階段的 SD 雄性大鼠 24 只，體質量(200±20)g。實驗所選用的大鼠由延邊大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(吉)2017-0003。水合氯醛(天津市大茂供應站)，鄰苯二甲醛、SCH-23390(D 受體阻斷劑)、L - 谷氨酸和 DA(美國 Sigma 公司)。8R-6 型腦立體定位儀(日本成茂公司)，HTEC-300 型生物活性物質微量分析系統和 EFC 82 型自動樣本收集器(日本 Eicom 公司)，交流放大器(英國 Neurolog 公司)，Micro3 型信號轉化器(英國 CED 公司)，穿梭箱(上海移數科技有限公司)。

　　1.2 實驗動物分組和處理

　　將大鼠隨機分為非訓練組、訓練組、對照組和 SCH 組，每組 6 只。非訓練組大鼠只放入穿梭箱內不進行訓練，訓練組大鼠每天在固定時間段進行穿梭箱訓練，每天訓練結束后檢測大鼠海馬 DG 區細胞外液中 DA 水平。對照組和 SCH 組大鼠每天進行穿梭箱訓練前，分別向 2 組大鼠海馬 DG 區注射 1μL 生理鹽水或 D1 受體阻斷劑 SCH-23390，觀察大鼠的主動回避反應率、DG 區 Glu 水平和場興奮性突觸后電位(fEPSP)幅值的變化。

　　1.3 大鼠海馬定位和透析探針的植入

　　大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛(300mg⋅kg−1)進行麻醉，待大鼠深度麻醉后取腹臥位固定于定位儀上，常規消毒后，切開頭皮，根據 Paxinos 和 Watson 圖譜將微量透析探針的外套管垂直地插入大鼠右側海馬 DG 區上方 1mm 處，定位坐標為前后(AP)3.2mm、中縫線右旁開(R)1.6mm、硬腦膜下深度(H)2.5mm。因為對照組和 SCH 組大鼠除了行為學訓練和微量透析以外還需測定突觸可塑性指標 - EPSP 幅值，因此埋植微量透析探針外套管的同時，在相同部位插入記錄電極，并在同側穿通纖維(perforant path，PP)處插入刺激電極。記錄電極的定位坐標為 AP3.2mm、R2.0mm H3.5mm，刺激電極定位坐標為 AP6.9mm R5.0mm、H4.5~5.0mm。外套管和 2 種電極采用牙托粉固定，隔天經外套管將微量透析探針插入海馬 DG 區并采用蠟封固。微量透析探針前端為 1mm 長的半透膜(內徑 0.20mm，外徑 0.22mm 日本 Eicom 公司)，側面粘合微量注射用細管。

　　1.4 大鼠主動回避反應率的測定

　　采用穿梭箱對大鼠進行主動回避條件反射實驗，包括條件反射建立和實驗性消退兩個部分。將大鼠放入穿梭箱后自由活動 2min 使之適應實驗環境，然后開始訓練，訓練時先給予聲音刺激 10s，再給予電刺激 15s，間隔 20s 后，重復上述操作，40 次為一輪完整的訓練。達到條件反射建立標準之后進行實驗性消退實驗，此時只給予聲音刺激不給予電刺激。規定只有聲音刺激出現時大鼠逃到對側安全區而躲避了電刺激為 1 次主動回避反應，主動回避率達到 65% 以上為條件反射建立標準，回降到 35% 以下為條件反射消退標準。整個訓練周期為 1 周。

　　1.5 DG 區微量透析樣本采集和微量注射

　　非訓練組和訓練組大鼠在每天的穿梭箱實驗結束后，其微量透析探針連接微量泵，以1.5μL⋅min−1的速度向大鼠海馬 DG 區灌流改良林格爾液，30min 后采用自動樣本收集器收集 DG 區細胞外液的微量透析樣本，每管收集 10min，每次收集 3 個管。對照組和 SCH 組大鼠在每天進行穿梭箱訓練之前，經微量注射用細管向海馬 DG 區注射 1μL 相應藥物，微量注射速度為0.5μL⋅min−1，注射藥物包括生理鹽水(對照組)或 SCH-23390(SCH 組，1 g⋅L−1)，注人時程為 2min，滯留 1min 后將細管與探針分離，給藥結束后 30min 開始進行穿梭箱訓練，訓練結束后收集大鼠 DG 區細胞外液的微量透析樣本，收集方法與訓練組相同。

　　1.6 大鼠 DG 區細胞外液中 DA 和 Glu 水平檢測

　　DA 水平檢測：將 12μL 微量透析樣本注入到生物活性物質微量分析系統中，樣本以0.23 mL⋅min−1的速度流經系統中的高效液相色譜分離柱和電化學檢測器，檢測大鼠 DG 區細胞外液中 DA 水平(單位：μg⋅L−1)。Glu 水平檢測：將 12μL 微量透析樣本與 3μL、4mmol⋅L−1鄰苯二甲醛溶液混合均勻，常溫下反應 2.5min 后抽取 10μL 反應液注入到生物活性物質微量分析系統中，經高效液相色譜分離柱和電化學檢測器測定各樣本中 Glu 水平(單位：mmol⋅L−1)。主動回避學習過程中大鼠訓練前各自的基礎 DG 區 DA 及 Glu 水平定義為 100%，計算大鼠每天訓練后 DG 區 DA 和 Glu 水平(以百分率表示)。

　　1.7 大鼠海馬 DG 區 IEPSP 幅值的測定

　　大鼠海馬 DG 區突觸傳遞效應用 EPSP 幅值表示，EPSP 幅值增加提示 LTP 形成。測定方法：通過靈活的刺激隔離器發出單個方波脈沖電刺激(0.1ms/phase，強度為引起最大 EPSP 效應的刺激強度的 1/3，間隔 30s)作用到 PP，誘發出的反應由交流放大器進行過濾(0.5~2.0kHz)和放大，將電信號數字化，采用 Spick2 軟件記錄 15 個連續的波痕后進行統計學分析。以主動回避訓練前 fEPSP 幅值的基礎水平為 100%，計算大鼠每天訓練后的 EPSP 幅值(以百分率表示)。

　　1.8 統計學分析

　　采用 Prism3.0 統計軟件進行統計學分析。大鼠海馬 DG 區 DA 和 Glu 水平、EEPSP 幅值和主動回避反應率均以xˉ±s表示，大鼠海馬 DG 區的 DA 水平組間比較采用 t 檢驗，在主動回避訓練過程中各種大鼠主動回避反應率和海馬 DG 區 Glu 水平及 fEPSP 幅值組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

　　2 結果

　　2.1 主動回避學習中大鼠海馬 DG 區 DA 水平

　　訓練組和非訓練組大鼠海馬 DG 區細胞外液微量透析樣本中 DA 基礎水平分別為(0.46±0.08)和(0.41±0.01)μg⋅L−1，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。在主動回避反應訓練中，訓練組大鼠主動回避反應率隨訓練天數的增加而升高，在訓練第 5 天達到條件反射的建立標準(68.05%±2.02%)，隨后進行實驗性消退，在訓練第 7 天達到消退標準(28.53%±3.53%)。訓練組大鼠 DG 區細胞外液中 DA 水平隨條件反射的建立逐漸升高，訓練第 5 天時達到最大值，高于第 1 天時的 DA 水平(P<0.05)，并隨著消退實驗回降到訓練前水平。非訓練組大鼠第 2~7 天海馬 DG 區 DA 水平與第 1 天比較差異無統計學意義((P>0.05)。在穿梭箱訓練第 3~5 天，訓練組大鼠 DG 區 DA 水平明顯高于非訓練組，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

　　2.2 主動回避學習過程中大鼠主動回避反應率

　　在主動回避反應訓練中，對照組大鼠主動回避反應率隨著訓練天數的增加而升高，在訓練第 5 天達到條件反射的建立標準;隨后進行消退實驗，在第 7 天達到消退標準。SCH 組大鼠在主動回避反應訓練過程中主動回避反應率有升高的趨勢，但直到訓練周期(共 7d)結束亦未能達到條件反射建立標準，提示阻斷 DG 區 D1 受體可明顯抑制主動回避學習過程。

　　2.3 大鼠 DG 區 Glu 水平

　　在主動回避條件反射建立階段，對照組大鼠 DG 區 Glu 水平隨著訓練天數的增加逐漸升高，第 4 和 5 天大鼠 DG 區 Glu 水平明顯高于第 1 天(P<0.05);在隨后的消退實驗過程中 Glu 水平逐漸回降到訓練前水平。SCH 組大鼠海馬 DG 區 Glu 水平在主動回避訓練期間變化不明顯，與對照組比較，在訓練第 5 天 SCH 組大鼠 DG 區 Glu 水平明顯降低((P<0.05)。

　　2.4 大鼠 DG 區 fEPSP 幅值

　　在主動回避反應訓練過程中，對照組大鼠 DG 區 EPSP 幅值在條件反射建立階段隨著訓練天數的增加逐漸變大，第 5 天達最大值，且高于第 1 天(P<0.05)，并在隨后的消退實驗過程中逐漸降低。SCH 組大鼠海馬 DG 區 fEPSP 幅值在主動回避訓練期間未出現明顯變化，與第 1 天比較差異無統計學意義(P>0.05);而且在訓練第 3、5 和 6 天，SCH 組大鼠海馬 DG 區 EPSP 幅值明顯低于對照組(P<0.05)。

　　3 討論

　　學習形成與記憶獲得的過程主要發生在海馬結構內 ，海馬結構在細胞水平上分為 CA1、CA2、CA3 和 DG 區，其中 DG 區主要負責對新信息進行處理和編碼。DA 是重要的中樞神經遞質，參與運動、記憶、注意和獎賞等多種腦功能的調節。DA 在腦內的神經傳遞依賴于兩大類 G 蛋白偶聯受體，即 D1(D1 和 D5)和 D2(D2~D4)家族受體，其對于腺苷酸環化酶(adenylate cyclase，AC)的作用是相反的。海馬接收來自于黑質(substantia nigra，SN)和腹側被蓋區(ventral tegmental area，VTA)等處多巴胺能神經元的傳入，研究顯示：活化 VTA 使得 DA 在海馬內釋放，對大鼠被動回避學習和海馬突觸可塑性起重要的調節作用;同時，如果 VTA 失活就會損傷 L.TP 的維持。作為突觸傳遞效應的活性依賴性調節方式，LTP 是中樞神經系統內突觸可塑性的典型表現，也是海馬學習記憶功能的重要生理學機制之一 。研究顯示：海馬 LTP 在條件反射建立過程中出現，并在條件反射消退過程中消失，且其最高水平和完全消失發生在條件反射相關行為時，提示該類型 LTP 與學習有關聯，即 LD-LTP。雖然不少證據表明：海馬 CA1 區 DA 及其 D1 受體參與調節空間學習記憶和被動回避反應等多種學習記憶過程，且 DG 區觀察到了 D1 受體的表達 ，但大鼠 DG 區 DA 及其 D1 受體是否參與主動回避學習目前尚不清楚。本實驗中大鼠海馬 DG 區 DA 水平和 EPSP 幅值隨著主動回避條件反射的建立逐漸增加，其后隨條件反射消退而回降，提示海馬 DG 區 DA 可能參與調節主動回避學習過程中的 LD-LTP。

　　研究顯示：海馬區的 LTP(包括 LD-LTP)的形成和維持由 Glu 及其促離子型受體所介導，而后者主要包括 N - 甲基 - D - 天冬氨酸(N-methy) D-aspartic acid，NMDA)受體和 α 氨基 - 3 - 羥基 - 5 甲基 - 4 - 異惡唑丙酸(amino-3-hydroxy-5-methy) 4-isoxazolepropionic acid，AMPA)受體。本課題組先前的研究顯示：海馬 DG 內的 Glu 參與大鼠主動回避學習及相關 LTP 的產生過程。研究顯示：采用 D1 受體激動劑處理離體海馬可增強 NMDA 和 AMPA 受體的磷酸化作用，進而使其介導的 EPSP 增強，而且在海馬 CA1 區 LTP 的誘發需要 D1 受體與 NMDA 受體的共同激活 。Kalivas 等發現：DA 可以調節興奮性氨基酸，即 Glu 的分泌，提示 DG 區內 D1 受體可能通過影響 Glu 的分泌來促進主動回避學習及其相關 LTP 的形成。阻斷大鼠 DG 區 D1 受體可明顯抑制主動回避學習以及該過程中 Glu 的釋放和 LD-L.TP 的產生 。本研究結果表明：大鼠 DG 區中的 DA 通過激活 D1 受體促進大鼠主動回避學習過程，并主要通過增加興奮性氨基酸的興奮傳遞來完成這一過程，但是 Glu 水平升高后是否通過 NMDA 受體和 AMPA 受體起作用，其受體激活的下游機制尚有待于進一步研究。

王瑋瑤;張巖;趙可;孫傳博;金清華,延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研室;吉林醫藥學院病理學教研室,201806